解讀真菌的形態發育
趙紹惠 和 大衛摩亞
Department of Biology, The Chinese
University of Hong Kong, Shatin, N. T., Hong Kong SAR, China
中國香港新界沙田 香港中文大學生物系
電郵地址E-mail address: siuwaichiu@cuhk.edu.hk
&
School of Biological Sciences, University
of Manchester, Manchester M13 9PT, U. K.
英國曼徹斯特市 曼徹斯特大學生物科學學院
電郵地址E-mail address: David.Moore@man.ac.uk
第五課：真菌細胞分化和形態發育
單細胞的分化可閱Chapter 2，這章討論減數分裂細胞、囊狀細胞和子實體的狀況。
單細胞的情況：
1. 減數分裂細胞
(meiocyte)
許多真菌的性器官是多細胞的，需要將器官解剖才可看到減數分裂細胞
(meiocyte) ，子囊菌的子實體許多都是細小的，只要將它放在玻璃片，製成壓片，便可在顯徵鏡下觀察子囊的形成 (ascomycetes)。雌性和雄性結構間的交配或兩性的菌絲融合導致：雄性細胞核遷移到雌性細胞形成產囊體，當中雌細胞核和雄細胞核配對但不融合(雙核期)，產囊體長出產囊絲，大部份細胞保持這雙核狀態(dikaryotic；核配對隨菌絲生長而進行共同分裂 (conjugate division) ，典型的發育情況是：產囊絲彎曲成一個產囊絲鈎(crozier) ，產囊絲鈎內的雙核同時分裂為4個核，和形成2個隔膜，構成3個細胞：產囊絲鈎彎部細胞是雙核而其餘細胞是單核的，雙核細胞發育成子囊母細胞去進行核融合(karyogamy) ，發育成子囊，子囊完成減數分裂產生4個單倍體子核，若再進行有絲分裂，子囊內便有8 個子囊孢子，或更多的子囊孢子( ascus)。
雙倍體釀酒酵母在環境缺乏營養下，會進行減數分裂和產孢，利用操控營養的提供，可將酵母的分化同步化。因此，對這發育過程的專一基因表達 (differential gene expression) 、減數分裂所需的機制 (machinery)，和環境因素都可透過研究、觀察而得，再加上基因突變株
(mutants) 的應用，便可確定減數分裂細胞的分化特性。釀酒酵母既然可用簡單的培養基，生長週期短，而操控方便，這方面的結果較容易獲得，相對下，其他真菌的研究便較少。
遠在Buller 年代，我們已知道大部份擔子菌的減數分裂是不同步的
(asynchronous) (asynchronous
meiosis; Chiu & Moore, 1999)，除了鬼傘屬 (Coprinus species) ，Lu (1982) 看見灰蓋鬼傘 (Coprinus
cinereus) 每一時刻有70 –75%性細胞 (擔子) 進行同步的減數分裂，Pukkila et al. (1984) 和Hammad et al. (1993a) 就用子實層看到的減數分裂至孢子成熟的現象，作為一客觀形態發育的指標 (hymenium development)
，這亦廣為應用。
在不同時段，將子實層抽樣製成即看的玻璃片，在光學顯微鏡下，觀察和分類擔子分化的階段，可得關係: 灰蓋鬼傘(Coprinus cinereus) 擔子邁進減數分裂和產擔孢子的時間旅程 (hymenium
development)。0小時代表細胞核開始融合，減數分裂I 在第5 小時發生，減數分裂 II在第 6
小時、擔子梗在第 7.5 小時出現，擔孢子則在第9小時開始出現，第11
小時擔孢子開始深棕色，和第18 小時擔子釋放成熟的擔孢子(Hammad et al., 1993a)。
典型的無隔擔子源於一雙核菌絲的頂端細胞， 這細胞膨大和進行核融合和減數分裂， 在減數分裂的後期， 擔子頂端長出4個擔孢子梗，擔孢子梗支撐膨大生長的擔孢子， (擔子菌生產外生孢子，子囊菌則生產內生孢子) ， 擔子內的子核經擔孢子梗進入擔孢子，而且，或會在擔孢子彈射前進行一次有絲分裂
(Chiu & Moore, 1990c; Basidiome)。
在體外移殖環境下， 兩種鬼傘擔子活動速度會放慢 (Bastouill-Descollonges &
Manachere, 1984; Chiu & Moore, 1988a)， 正如McLaughlin (1982)用電池場影響在液體栽培的擔子形成擔孢子梗一樣， 擔子由減數分裂前期 I到擔孢子梗形成需要1天時間， Raju & Lu (1970) 測定在子實體上的擔子需要11.5小時完成減數分裂， 另外8-10小時產孢子，灰蓋鬼傘株Meathop只需要10小時完成減數分裂。就算培養基是水瓊脂， 結果都一樣，因此，減數分裂是自主進行的。
發育專一性 (Commitment)
大部份的真菌組織受到騷擾和被接種到一培養基上， 都會長出營養菌絲， 減數分裂期的體外菌褶則會完成產孢子的程序
(Descollonges & Manachere, 1984; Chiu & Moore, 1988a)， 所以， 擔子是在減數分裂前期 I 時決定進入產孢子的， 這可引証為真菌發育的專一性。Chiu & Moore (1988a) 的實驗手法被推廣成為一快速、小規模的生物測試法， 這樣地可測試添加的外間物是否調控物質
(modulator)， Chiu &
Moore (1988b) 証明胺鹽基ammonium ion 和谷氨酸阻止擔子分化， 擔子停止產孢子而營養菌絲在擔子生長點長出來。在測試pH和氨 (硫酸和氯離子)濃度影響時， 發現：
pH 值為6-8時， 體外栽培的菌褶繼續發育， 高pH值和氨離子的最小抑制劑量達50mM便抑制菌褶發育， 硫酸鉀和氯化鉀卻沒有這效果， 同樣地， 利用微針將20 μl 的
1M濃度氨離子注射到年幼的鬼傘菌蓋內， 會局部阻止發育，形成黑菌褶上的白區(鬼傘生產黑擔孢子， 因而成熟期的菌褶是黑色的)， 雙核期的子實體則抵受不了實驗操作的傷害而流產， 其他期間， 若取代以水或緩冲液注射， 並無影響， 將體外和體內測試的結果比較， 不難發現： 氨離子在體外的環境下， 完全抑制抽離的小片菌褶，但在整個子實體的體內測試時， 只是拖慢減數分裂速度，沒壓抑產孢子。當菌褶到達產孢子階段， 兩種測試法都表達抑制作用
(Chiu & Moore， 1988a) ； 雙核時期的抽離不導致營養菌絲出現；細胞核融合後， 擔子發育受抑制， 但氨離子的作用不只是停止分化， 部份擔子改到營養生長， 因此， 氨離子的直接作用是打破擔子分化的專一性。 而且菌絲就在生長點如：擔孢子梗長出；如擔孢子梗已長出， 取代擔孢子的是菌絲；若擔孢子已出現， 氨離子就不讓它完成發育， 而改成菌絲尖 (ammonium toxicity)
；還有， 菌絲可在擔孢子的底部出現。
Chiu & Moore (1990) 利用同一生化測試法， 考查金屬離子、去膜極化劑、離子戴體， 外加的cAMP和抑制細胞壁合成物，結果是： 氨離子、谷氨酰胺 和碱金屬對第一減數分裂後的擔子同樣有效， 而離子戴體、cAMP 和細胞壁合成抑制物對減數分裂的擔子有抑制作用， 因此，產孢子的準備是在減數分裂時做的， 另外， 除細胞核分裂外， 擔子的其他反應如合成細胞壁等， �m受考查的金屬離子、 氨離子和谷氨酰胺影響，這些抑制物都引起由擔孢子梗的位置長出菌絲，因此， 這些位置在分化早期便固定下來的。另外， 許多物質由底物類似物、細胞壁酶抑制物 (如： nikkomycin) 以至無機鹽如NaNO3
等都引起擔子返回營養生長： 在擔孢子梗位置長出菌絲。將所有相關的實驗作總結， 明顯地有一類： 氨離子和谷氨酰胺及它的類似物、 無機正離子和負離子等阻止第一減數分裂後的擔子完成分化和引致擔子長出菌絲， 第二類包括離子戴體、cAMP和細胞壁酶抑制物， 只有對擔子的減數分裂有抑制作用， 而且減數分裂和產孢子兩過程是可分開的。 致於氨離子的反應， 就表明受影響的過程可能與減數分裂無關， 或在產孢子期出現。
Lu (1972) 提出減數分裂前期 I
前10 個小時就是擔子程式化地進行細胞核融合和染色體配對， Raudaskoski
& Lu (1980) 就用hydroxyurea 去抑制DNA合成， 結局是擔子停在雙核期， Lu (1982) 提出這是決定性階段： 擔子繼續分化進行遺傳重組 (genetic recombination) 。套用研究釀酒酵母時常用的詞匯， 這分化的途徑就是： 專一化作遺傳組合，這不等同專一化作減數分裂， 而後者亦不等同專一化作生產擔孢子
(Berry, 1983; Dawes, 1983) 。
Raju & Lu (1973) 發現鬼傘擔子在雙線期 (diplotene)
時，已進行合成紡錘體 (spindle
pole body) ， 這應該是分化的檢查點
(checking points) ， 灰蓋鬼傘和釀酒酵母呈現共同的要求和出現遺傳重組和減數分裂兩個分化檢查點。 不同處是：若在這兩個檢查點期間， 將釀酒酵母抽離產孢培養基， 細胞會返回營養的生產模式(Berry, 1983)， 但在雙核期抽離灰蓋鬼傘， 擔子是停止發育的， 其他組織如側絲細胞會返回營養式的生產模式，掃描電子顯微鏡可見到這些新生菌絲甚至穿插到子實層面去(ammonium
toxicity;Chiu & Moore, 1988) 。
而減數分裂細胞 (meiocyte) 的分化有幾個里程碑/
檢查點 (Basidial
differentiation )。
a. 對基因重組的分化專一性 (要求完成DNA的合成, Lu, 1982) ，
b. 對減數分裂的分化專一性 (於前期一(prophase
I)階段, Lu &
Chiu, 1978; Chiu & Moore, 1988a) ，
c. 對產孢子的分化專一性 (於第二減數分裂後,
Raudaskoski & Lu, 1980; Chiu & Moore, 1988a, b) ，
d.
對擔孢子成熟的分化專一性 (Chiu & Moore, 1988b) 。
有趣的是：釀酒酵母 (Saccharomyces
cerevisiae) 的氨透性酶 (ammonium
permease) 探測氨離子和激活 cAMP訊息路徑，提升的cAMP水平致使假菌絲
(filamentation (formation of pseudohyphae)) 的出現
(Lorenz & Heitman, 1998)。
若從子實層構造看， 分佈廣而獨立的囊狀細胞、接囊狀細胞和子實層主要細胞類：側絲細胞 (Coprinus hymenium)
都沒有專一的分化， 只有擔子才是一細胞分化模式， 正因如此， 正常的子實層發育， 就需抑壓側絲細胞的生長， 好讓系統模式表現出來。
2. 囊狀細胞 (Cystidia)
擔子功能是細胞核融合、減數分裂和形成擔孢子這一命運途徑，子實層上可找到其他類的細胞，如：灰蓋鬼傘 (Coprinus cinereus) 的子實層有囊狀細胞
(cystidia) 和側絲細胞 (paraphyses)
。長久以來，囊狀細胞的形態多被用作分類用途， 囊狀細胞都被認為是不育而繼續生長的擔子 (Brefield, 1877; Corner, 1947) ，其實， 囊狀細胞的命運與擔子的不同， 它有自己的特定功能，而許多研究都忽略了形態發展的彈性
(developmental plasticity) 。
灰蓋鬼傘的囊狀細胞都從菌褶髓的菌絲長出(Moore et al., 1979;
Rosin & Moore, 1985b)， 所以， 過程包括分化
(cell differentiation) 和固定發展途徑。最初的子實層有擔子和8%
是體積較大的囊狀細胞 (Horner
& Moore, 1987)，而裂褶菌 (Schizophyllum
commune) 的擔子則是由子實層子層
(subhymenium)鎖狀連合生長出來的 (Niederpruem
et al., 1971; Niederpruem & Jersild, 1972) ， 成熟的鬼傘子實層還有側絲細胞 (paraphysis)
， 它們的膨大就隔開成長中的擔子
(Moore et al., 1979)， 約75%側絲細胞在減數分裂時出現
(Rosin & Moore, 1985b)， 其生長模式是：1-2 mm的子實體原基內的子實層是一層緊密的年青擔子和較大的囊狀細胞，而隔絲細胞剛在子實下層形成並未穿插出現在子實層。中期，隔絲細胞先長至擔子的2/3高度時，不延伸，只膨大 (圓而不定向的生長) ，隔絲細胞成長、膨大和穿插出現在子實層去分隔擔子，而隔絲細胞與擔子在子實下層仍是相連的。到最後， 一個擔子由五個側絲細胞包圍， 即80%以上的子實層細胞是作機械性支撐功能的， 另外，銀絲草菇與鬼傘一樣在菌褶邊和平面上都有囊狀細胞。
灰蓋鬼傘的面囊狀細胞 (facial cystidia) 由子實子層生長出來， 因而是雙核的， 邊囊狀細胞
(marginal cystidia) 就源自多細胞核的菌褶髓， 因而也是多細胞核的 (Chiu & Moore, 1993)， 銀絲草菇的囊狀細胞則都是多細胞核的，而囊狀細胞有水珠凝結， 可推斷為分泌功能 (Chiu & Moore, 1990b)， 但鬼傘的面囊狀細胞有建築工程的功能：
Buller (1909)和 Chow (1934)估計面和邊的囊狀細胞將兩面對的菌褶隔開 (facial
cystidium)， 防菌褶相撞， 但情況並非如此；
一： 鬼傘菌褶的菌髓是一開放組織和充滿空位 ， 沒有牢固的基底，
二：囊狀細胞橫跨兩菌褶，與對面子實層的連囊狀細胞(cystesia)
牢牢連結，calcofluor
white螢光劑的染色顯示：嶄新合成細胞壁上的幾丁質位於囊狀細胞與連囊狀細胞連結處(Chiu
& Moore, 1990)，相對下，囊狀細胞與連囊狀細胞強化隔鄰子實層的連結。
若作為分隔， 這連結就不需要， 固此， 面囊狀細胞功能是作為兩菌褶的橋樑，連接鄰近的菌褶成為一子實層體
(hymenophore)， 當菌蓋擴張時， 其拉力便透過囊狀細胞-連囊狀細胞對(cystidium-cystesium
pair)來平均分配到整個子實層體去。
多細胞的性器官- 子實體
1. 多細胞的性器
真菌組織的基本結構稱「密絲組織」(plectenchyma)， 其詞根是：希臘文 plekein(意謂編織)和enchyma (聯合)， 因此， 詞匯生動地表達真菌菌絲藉互纏而形成的結構。基本的「密絲組織」有二類型：疏絲長軸組織 (prosenchyma；希臘文 pros即向、近似的意思)， 專指一鬆弛互纏的菌絲組織；和擬薄壁組織 (pseudoparenchyma；希臘文 pseudo 即假、非真確的植物薄壁組織)。
Butler (1958) 、Townsend & Willetts (1954) 和 Reijnders (1977, 1993) 在許多不同種屬的球基、菌柄、菌幕、傘蓋、菌肉、菌絲索 (cord) 、菌絲線 (strands)
、菌核 (sclerotia) 等可見到菌絲扭結， 此為一團互纏協調分化的菌絲， 有些像是休眠， 有些已分化： 中央菌絲由一環或圓柱體的細胞包圍。菌絲扭結可能是真菌最基本的調控形態分化的目標物 (morphogenesis)。菌絲線是遷移的器官，負責去尋找食物源。 干朽菌 (乾腐爛菌Serpula lacrimans) 的菌絲索 (mycelial cord) 可穿透幾公尺的砌磚來覓食木材、甚至塑膠薄膜和建築材料，靈芝就生產假菌絲線，內有底物如泥粒、碎石和菌絲(Cheung & Chiu,
unpublished result)。
相對菌絲線，菌索 (rhizomorph) 表現嚴謹的、如植物根的分化和組織。樹和灌木的病源菌
(pathogen) 蜜環菌(Armillaria
mellea)，當中有許多形態近似的不同種；speices
complex) 的菌索將森林中樹木根部連接(Rishbeth,1985)。菌索負責雙向的運輸和遷移的功能(Granlund et al., 1985)。菌索擁有一高度組織的前端生長點而且展現極端的頂優勢 (apical
dominance)。 在菌索的前端區域有緊密的細胞相連， 然後接連是中髓部份， 散佈於這區域的空間或黏液上有肥大的、具液胞的和通常是多核的細胞， 這個中髓區域形成菌索的中央通道。 成熟的菌索中髓部份縱橫交錯著狹窄的纖維菌絲和寬直徑的導管菌絲， 外皮層的細胞則較小、較黑， 而且有厚壁， 甚至外延有擴散的菌絲，與植物根相似。菌索直切面展示前端為緊密排列的細胞，菌索髓區則有肥大的、有空泡的和常是多細胞核的細胞，細胞間則充滿空氣或黏液，除此外，髓區的中央通道有狹窄的纖維狀菌絲和成熟的寬直徑管菌絲。
另外，潮濕森林中暴露於空氣的菌索主要是由小皮傘 (Marasmius
spp.) 架設的， 將墮落的鮮葉攔截， 形成懸掛的垃圾層(Hedger, 1985; Hedger et al., 1993)。 Hedger et al. (1993) 發現這些菌索尖有一退化似的菌蓋保護免受乾燥。這些空中的菌索與泥土中的功能是類似的， 但發育上則與菌柄的不定生長類似 (Jacques-Felix, 1967)。
許多學者推斷菌索有分生組織 (meristem)，如：擔子果體內可找到平行而快速生長的組織層。Reijnders (1977) 就時常將擔子果分層定界線，並稱為 meristemoids (類分生組織層)。植物分生組織的細胞在各個不同的平面都可進行細胞有絲分裂， 產生一有秩序的組織， 形成整個頂端區域一起生長，其他部分則負責分化或特化的功能。這對真菌是絕對錯誤的。
形態發育可視為一至數個平行而獨立的子程序(subroutines) (development)
。Chiu et al. (1989) 認為操控和協調擔子果形態發育這些子程序 (有形的結構如：
底座、菌葢、孢子等， 和「無形」的操控)， 便成為標準生長發育的模式， 這個想法和 Gregory (1984) 和 Rayner & Coates (1987) 營養菌絲的「模態開關」(mode switch) 概念是一致的。但是，協調子程序的工作若沒落實，畸形/異形發育使出現；若複制菌褶過程不停止和在擔子果成熟期繼續出現， 則子實層體會出現複雜如蜜蜂巢的情況， 與Lentinus 香菇屬或銀絲草菇的超多子實層體 (supernumerary hymenia) 發育異種所見的一樣 (Chiu et al., 1989; Hibbett et al.,
1993a)。
